Etude des propriétés de la polyphénol oxydase, EC 1. 14. 18. 1) du champignon de Paris (Agaricus bisporus J.E Lange Imbach)

Abstract

La polyphénol oxydase (PPO; EC 1.14.18.1) du champignon de Paris (Agaricus bisporus (J.E. Lange) Imbach) est extraite en milieux aqueux à l'aide d'une poudre d'acétone. L'extrait brut obtenu est partiellement purifié par précipitation par l'acétone suivie d'un fractionnement au sulfate d'ammonium à 60%. Cette enzyme possède deux activités, monophénolase et diphénolase mesurées par spectrophotométrie à 420 et 475 nm pour le pyrogallol et la L-tyrosine, respectivement. Un taux de purification de 2 fois est obtenu pour les deux activités, par la précipitation au sulfate d'ammonium. Les activités monophénolase et diphénolase, sont respectivement 3.35 UE/ml et 189.3 UE/ml. La PPO reste stable à -15°C pendant 44 jours. L'enzyme n'est pas très thermostable. Son activité diphénolase diminue lorsqu'elle est incubée à des températures supérieures à 35°C. Elle se caractérise par deux pH optimaux, (5.3 et 7.0 à 25°C), quand le pyrogallol est utilisé comme substrat et La vitesse initiale d'oxydation de ce dernier dépend de la concentration de l'enzyme. L'activité diphénolase est optimale à pH 7.5 lorsque le pyrocatéchol est utilisé comme substrat. Une faible activité laccase représentant seulement 0.22% de l'activité totale de l'enzyme a été mesurée. Les mono-, di- et triphénol ont été des substrats pour la PPO. Utilisant VmaX/Km comme constante de spécificité, le pyrocatéchol est le meilleur substrat suivie par le pyrogallol. Les paramètres cinétiques de l'enzyme sont : V.« = 80 UE/min/ml, Km = 1.4 mM et Ks = 250 mM pour le pyrogallol et Vm = 168 UE/min/ml, Km = 0.40 mM et Ks = 270 mM pour le pyrocatéchol. L'inhibition de la PPO du champignon de Paris a été étudiée avec l'acide benzoïque, l'azide de sodium et le fluorure de sodium comme inhibiteurs, le pyrocatéchol et le pyrogallol comme substrats. La PPO du champignon de Paris a été fortement inhibée par les inhibiteurs testés. L'analyse cinétique de l'inhibition de l'activité triphénol oxydase montre que l'acide benzoïque et l'azide de sodium sont des inhibiteurs compétitifs, avec des valeurs K1 de 0.0498 et 3.22 mM, respectivement. L'inhibition par le fluorure de sodium est mixte-type I, avec des constantes K1 de 81.08 mM et Ki5 de 161.14 mM pour le pyrogallol utilisé comme substrat. L'activité diphénol oxydase montre une inhibition mixte-type I avec l'azide de sodium. Les valeurs de Ki et K15 sont respectivement, 1.39 et 3.12 mM. Une inhibition de type compétitif est obtenue avec l'acide benzoïque utilisé comme inhibiteur. La constante d'inhibition K1 étant de 0.046 mM. Une inhibition mixte-type II est obtenue avec le fluorure de sodium en utilisant le pyrocatéchol comme substrat, avec K1 =148.97 mM et Kis = 49.19 mM. Les valeurs d'1050 sont estimées à 0.147 mM, pour l'acide benzoïque, 3.20 mM pour l'azide de sodium et 123.94 mM pour le fluorure de sodium. L'acide benzoïque, au vu de la faible valeur Ki, est apparemment l'inhibiteur le plus efficace, lorsque le pyrogallol et le pyrocatéchol sont utilisés comme substrats.