Contribution à l'étude des paramètres cinétiques de l'ascorbate oxydase de courgette verte ( Cucurbita pepo meduiosa). Ebauche d'un capteur optique pour le dosage de l'acide ascorbique

Abstract

Ce travail est une contribution à l'étude des paramètres cinétiques de l'ascorbate oxydase de courgette (Cucurbita pepo medullosa). II comporte aussi une ébauche d'un dispositif optique conçu pour le dosage de l'acide ascorbique au moyen d'une méthode utilisant l'ascorbafe oxydase. L'ascorbate oxydase extraite de courgette verte a été partiellement purifiée selon des méthodes de précipitation (précipitation par le sulfate d'ammonium et fractionnement par l'acétone). Un suivi d'activité enzymatique pour chaque fraction obtenue après purification o été effectué sur une période de cinq mois. Seul l'extrait brut d'ascorbafe oxydase o présenté une relative stabilité contrairement aux deux fractions obtenues après purification. Son activité moyenne était de 568 ± 85 Ul/mJ dans les conditions standards définies. L'activité de l'ascorbate oxydase a été étudiée notamment en fonction du pH, de la température, de la concentration en substrat (acide ascorbique) et en présence d'un inhibiteur (le sulfite de sodium). La mesure des vitesses initiales d'oxydation a conduit aux résultats suivants: L'ascorbate oxydase présente une activité maximale à pH 5,6 et à une température de 45°C. Cette enzyme subit une inhibition par excès de substrat, on a: Vmax = 6176,33 pmoL1 -1 .min-1 , Km = 1,4x10-3 mol.1-1 , Ks = 1,2x10-3 molt1 . Le sulfite de sodium (additif alimentaire utilisé comme conservateur sous la référence E221) exerce une inhibition incompétitive sur I 'ascorbate oxydase. Un protocole de dosage colorimétrique de l'acide ascorbique par iodométrie a été établi. Les essais réalisés sur des échantillons (jus de fruits commercial, comprimé de vitamine C) ont montré que cette méthode pouvait permettre de doser spécifiquement l'acide ascorbique si on lui ajoutait une étape faisant intervenir l'ascorbate oxydase. Un dispositif optique permettant d'associer une différence de potentiel électrique (d.d.p.) à la «couleur» de l'échantillon analysé a été conçu. H permet d'obtenir une relation de proportionnalité entre la d.d.p. mesurée et la concentration en acide ascorbique dans l'échantillon analysé. Mots clés: Ascorbate oxydase, métalloprotéine, acide ascorbique, Cucurbita pepo medullosa, biocapteur. Summary: This work is a contribution to the study of the kinetic parameters of the ascorbate oxidase of zucchini (Cucurbita pepo medullosa). It also indudes a draft of an optical device designed for the assay of ascorbic acid by means of o method using ascorbaf e oxidase. The ascorbate oxidase extracted from green zucchini has been partially purified by precipitation methods (ammonium sulfate precipitation and tractionation with acetone). A foflow-up of the enzymatic activity for each fraction recovered after purification has been carried ouf over a five month period. Only the raw ascorbate oxidase exfracf presenfed o relative stability contrary to the Iwo fractions recovered after purification. Its mean activity was 568 ± 85 Ul/ml in the detined standard conditions. Ascorbate oxidase activity has been studied as a function 0f pH, temperature, substrate (Le. ascorbic acid) concentration, and in the presence of an inhibitor (Le. sodium sulfite). The determination of initial oxidation rates gave the tollowing resulfs: The ascorbafe oxidase extracfed from zucchini presenfs o maximum activity at pH 5.6 and at a temperature of 45°C. This enzyme undergoes an inhibition by excess substrate. The determined parameters are: Vmax = 6176.33 pmolk.min* Km = 1 .4x10 -3 molt', Ks = L2x1&3 molk. Sodium sulfite (a food preservative used under reference E221) is an uncompefif ive inhibifor of ascorbafe oxidase. A protocol for the colorimetric determination of ascorbic acid concentrations based on iodimetry has been established. The tests performed on samples (commercial fruit juice, vitamin C tablets) showed thaf this mefhod could be used fo ossay ascorbic acid specificolly if an additional step using ascorbate oxidase was performed. An optical device linking an electric potential difference to the color" of the analyzed sample has been designed. A proportionality relationship between the measured electric potential difference and the concentration of ascorbic acid in the analyzed sample was observed. Key words: Ascorbate oxidase, metalloprotein, ascorbic acid, Cucurbifa pepo medullosa, biosensor. :u