Contribution à l'étude de la polyphénol oxydase d'Agaricus bis porus. Conception d'un système à fibre optique pour le dosage des composés phénoliques en solution

Abstract

II RI&JM! Dans cette étude la polyphénol oxydase (PPO; EC : 1.14.18.1) a été, tout d'abord, - extraite en milieux aqueux à partir d'une poudre d'acétone de champignon de Paris (Agaricus bisporus). L'extrait brut d'enzyme est ensuite partiellement purifié par précipitation par l'acétone suivie d'un fractionnement par le sulfate d'ammonium à 60%. Nous avons - observé que les différents extraits enzymatiques brut et partiellement purifiés possèdent deux activités catécholase et crésolase mesurées par spectrophotométrie à 420 et 475 Mn pour le pyrogallol et la L-tyrosine respectivement. En fin de purification, l'activité enzymatique est - doublée pour les deux activités. L'activité volumique déshydrogénase atteint 189,3 et 3,35 U.E/ml pour l'activité hydroxylase (30°C, pH 7- tampon phosphate de sodium 0,1M). Les extraits des enzymes stockés à -15°C pendant 44 jours sont relativement stables. On a constaté l'existence d'une faible activité laccase qui représente seulement 0,22 % de l'activité total polyphénol oxydase. L'étude des effets du pH, la spécificité du substrat, la concentration du substrat et d'enzyme et la température, a été effectuée. Deux pH optimaux ont été trouvé pour les différents extraits d'enzymes, l'un est de 5,3 et l'autre est de 7 ou 7,6 avec le pyrogallol comme substrat utilisant soit l'extrait brut et partiellement purifié par le sulfate d'ammonium soit par précipitation par l'acétone. Il est remarquable que l'activité enzymatique soit maximale au voisinage de la neutralité. Il s'est avéré aussi que le pH optimal de l'enzyme dépend du degré de pureté de l'enzyme et du substrat phénolique. La PPO peut catalyser les mono-, di- et les triphénols avec une préférence variable. En terme d'efficacité catalytique (Vtiax/Km), le catéchol représente le meilleur substrat pour l'enzyme. Les paramètres cinétiques de l'enzyme d'extrait brut sont: V n ax = 78,6 (U.E/min.mI), Km = 1,4 mM et K = 249,82 mM pour le pyrogallol et V,, = 168,72 (U.E/min.ml ), K1 =0,40 MM et K = 269,83 mM pour le catéchol. La vitesse initiale d'oxydation du pyrogallol dépend de la concentration d'enzyme. De même, l'activité de l'enzyme augmente en fonction de la température entre 25 et 50°C). L'énergie d'activation de la réaction d'oxydation du pyrogallol est de 22 0/mol. L'étude de la stabilité thermique montre que la PPO est une enzyme qui n'est pas thermostable. Son activité diminue lorsqu'elle est incubée pendant 30 min aux températures supérieures à 35°C. L'effet de la nature du solvant du milieu réactionnel sur la cinétique d'oxydation du catéchol par la PPO a été étudié. Il a été observé que l'enzyme peut fonctionner dans des milieux organiques et que son activité enzymatique en milieu organique est nettement inférieure par rapport aux milieux aqueux. La présence de 14% d'eau dans le milieu réactionnel suffit pour activer l'enzyme à 50%. L'inhibition de la PPO a été étudiée avec des inhibiteurs comme l'acide benzoïque, l'azide de sodium, la L-cystéine et le fluorure de sodium. Une inhibition de type compétitive a - été obtenue avec l'acide benzoïque et l'azide de sodium. Une inhibition de type mixte a été obtenue avec la L-cystéine et le fluorure de sodium. L'acide benzoïque et la L-cystéine sont les inhibiteurs les plus efficaces. Le dosage des composés phénoliques par la PPO faite par un système à fibre optique (DEL470 ) réalisé dans notre laboratoire c'est avéré plus sensible et reproductible dans la gamme des concentrations du catéchol étudiées par rapport à la mesure traditionnelle par spectrophotométrie (UV/Vis) à 470 nm et dans les mêmes conditions. L'étude comparative entre notre système optique et celui spectrophotomètre Jenway 6405 (UV/Visible), montre que les valeurs obtenues sont très rapprochées. Mots clés : Champignon de Paris, Agaricus hisporus, Polyphéno! oxydase, Isolation, caractérisation, biocapteur, fibre optique, DEL, Phototransistor, composés phénoliques. III ABSTRACT In this study the polyphenol oxidase (PPO; E.C: 1.14.18.1), was firstly extracted in aqueous mediums from acetone powder of the mushroom (Agaricus bisporus).The crude extract of enzyme is then partially purified trough acetone and (NIH) 2SO4 precipitation. We observed that the différent enzyme extracts crude and partially purified exhibit both activity catecholase and cresolase measured spectrophotometrically at 420 and 475 nm usina pyrogallol and L-tyrosine as substrate respectively. At the final step of the purification, 2-fold purification was achieved for the two activities. The deshydrogenase enzymatic activity was 189,3 and 3,35 U.E/ml for the hydroxylase activity (30°C, pH 7 phosphate buffer 0,1 M). The extracts of the enzymes were relatively stable when they are stored at -15°C during 44 days. A much lower laccase activity was observed who represents only 0,22% of the total activity polyphenol oxydase. The effects of the pH, temperature, substrate specificity, concentration of the substrate and enzyme, were investigated. Two optimal pH values for the various extracts of enzymes were found, one is 5,3 and the other is 7 for both crud extract and partially purified enzyme with ammonium suiphate at 60 % or 7,6 for the enzyme extract purified with accorte with pyrogallol as substrate and it is remarkable that the enzymatic activity is maximum near the neutrality. it also proved that the optimal pH of the enzyme depends on the purity of the enzyme and the phenolic substrate used. The PPO can catalyse the mono-, di- and triphenols with a preference of the substrate. According tO Vmax/Kni, the catechol was the best substrate followed hy pyrogallol. The kinetic parameters of the enzyme crude extract where found at pH 7 and 25°C are : = 78,6 (U.E/min.ml ), K. = 1,4 mM and K5 = 249,82 MM for pyrogallol and Vmax = 168,72 (U.E/min.ml ), Km = 0,40 mM and K 5 = 269,83 mM for the catechol. The initial rate of the pyrogallol oxidation was affected by the concentration of enzyme. In the same way, the activity of the enzyme increases with the increase of the temperature between 25 and 50°C. The activation energie (Ea) for the pyrogallol enzymatic oxidat ion was 22 kJ/mol. The study of the thermal stability shows that the PPO is flot a very heat stable enzyme and that its activity decreases when it is incubated during 30 min at the temperatures higher than 35°C. The effect of the nature of solvent of the reactional medium on the kinetics oxidation of the catechol by the PPO was studied. It was observed that the enzyme can function in organic mediums and that its activity in organic medium is significantly lower than in an aqueous medium. The presence of water at 14 1/o in the reaction medium was sufficient for activate the enzyme at 50%. The inhibition ofPPO was studied with inhibitors such as benzoic acid, sodium azide, L-cysteine and fluoride sodium. A competitive-type was obtained with the benzoic acid and - . sodium azide. A mixed-type was obtained with the L-cysteine and fluoride of sodium. Benzoic acid and the L-cysteine are the most effective inhibitors for mushroom PPO. The monitoring of the phenolic compounds with the PPO made by an optical fibre system (LED470 ) realized in our laboratory, it was shown more sensitive and reproducible in the range of the studied concentrations of the càtechol than that the traditional measurement by spectrophotometry (UV/Vis) at 470 nm and under the same conditions. The comparative - study between our optical system and that spectrophotometer Jenway 6405 (UV/Visible), shows that the values obtained are very brought doser. Keywords: Mushroom, Agaricus bisporus, Polyphenol oxydase, extraction, characterization, biosensor, optical fibre, DEL. Phototransistor, phenolic compounds.