EFFET DES LIPOPROTEINES SERIQUES SUR LA CYTOTOXICITE INDUITE PAR LES POLYENES MACROLIDLS EXEMPLE DE L'AMPHOTERICINE B, CHEZ LES CELLULES DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Abstract

Le travail que nous avons entrepris avait pour but d'évaluer l'effet des lipoprotéines du sérum sanguin sur la cytotoxité des antifongiques poiyènes entre autres l'amphotéricine B. Les travaux antérieurs sur le globule rouge humain (Brajtburg.J. et ai 1984) et sur les cellules rénales (Wasan et al 1994), montraient que lorsqu'on associe l'amphotéricine B à des lipoprotéines sériques, on observait une réduction de la toxicité. La question posée est de savoir, si dans les mêmes conditions l'amphotéricine B garderait toute son efficacité vis-à-vis des levures en vue d'une utilisation thérapeutique. Les résultats que nous avons obtenus chez les levures, saccharomyces cerevisiae montrent que: 1- L'amphotéricine B complexée aux lipoprotéines sériques inhibe la croissance cellulaire de saccharomyces cerevisiae dès les concentrations - d'amphotéricine B de l'ordre de 2pg/ml, et augmente la perméabilité de ces cellules isolées de leur milieu de culture et maintenues dans un état stationnaire par - resuspension dans un milieu salin tamponné. - 2- Les effets obtenus dépendent des concentrations relatives de l'amphotéricine B, des lipoprotéines sériques et des cellules de saccharomyces cerevisiae. Sur la base des propriétés physico-chimiques d'amphotéricine B liée au caractère amphiphile, de celles des lipoprotéines sériques (présence d'un environnement hydrophobe et de molécules de cholestérol non estérifié), il a été possible de moduler de façons différentes la concentration d'amphotéricine B mise à disposition pour une interaction avec les cellules cibles de saccharomyces cerevisiae: a- Soit en faisant varier la concentration de lipoprotéines sériques dans le milieu, celle d'amphotéricine B restant fixe. b- Soit inversement, en faisant varier la concentration d'amphotéricine B, celle des lipoprotéines sériques restant constante.En utilisant ces deux protocoles, il a été possible d'observer les principaux faits suivants: - 1- En ce qui concerne l'effet de concentrations croissantes des lipoprotéines - sériques sur l'amplitude des phénomènes toxiques d'amphotéricine B, nos résultats montrent que lorsque les concentrations d'amphotéricine B sont de l'ordre de 1 - g/ml, l'addition de lipoprotéines sériques dans le milieu d'essai contenant les cellules de saccharomyces cerevisiae, induit un effet protecteur relatif (50% de fuite potassique par rapport au contrôle). Dès les concentrations d'amphotéricine B de - l'ordre de 2pgIml, les lipoprotéines sériques montrent un effet protecteur transitoire. Cet effet apparaît à des périodes d'incubations courtes (25 minutes). Les lipoprotéines légères, LDL montrent par ailleurs, un effet protecteur significativement moins important que celui des lipoprotéines lourdes, HDL. Lorsque les périodes d'incubation deviennent supérieures à 30 minutes, les lipoprotéines sériques modifient seulement les cinétiques de fuite de potassium intracellulaire, sans affecter l'état stationnaire. Ces résultats sont en accord avec ceux de HAMMOND et ai 1974, qui ont montré que l'augmentation de la perméabilité ionique se produit au cours des premières minutes de l'addition de l'antifongique, alors que, la présence de lipoprotéines dans le milieu inhibent significativement les cinétiques de fuite du potassium interne des cellules de candida albicans. 2- En ce qui concerne l'effet dose-réponse c'est-à-dire l'effet de concentrations croissantes d'amphotéricine B à concentration fixe de lipoprotéines, - l'addition de l'amphotéricine B libre dans le milieu de cellules de saccharomyces cerevisiae, induit une fuite potassique significative, dès les concentrations de l'ordre de 0.5 pg/ml. Un maximum de fuite potassique (16% de K retenu par rapport au contrôle), n'est atteint qu'à partir de concentrations d'amphotéricine B de l'ordre de 5pg/ml, dès les cinq premières minutes d'incubation à 370c.L'addition des lipoprotéines sériques natives, (de concentrations équivalentes à celles du plasma sanguin) induit un effet protecteur entre O et 25 minutes d'incubation. Cet effet se réduit d'une manière importante pour disparaître à deux heures d'incubation à 37c dès les concentrations de l'amphotéricine B de l'ordre de 5 pg/ml de solution. L'addition de lipoprotéines sériques de concentration en cholestérol de moitié et au 1/10 à celle du plasma sanguin, montrent des effets différents sur la toxicité de l'amphotéricine B suivant le type de lipoprotéines sériques: A des concentrations d'amphotéricine B de l'ordre de lpg/ml, et durant des périodes d'incubation courtes (25 minutes): - Les lipoprotéines lourdes, HDL induisent un effet protecteur important (83% de K+ retenu par rapport au contrôle.) - Les lipoprotéines légères LDL montrent aussi un effet protecteur de l'action toxique de l'amphotéricine B. Cependant cet effet est significativement plus réduit que celui induit par les HDL. A des périodes d'incubation, longues (2 h), seules les lipoprotéines sériques I-IDL montrent un effet protecteur minime. (50% de K+ retenu.) Dès les concentrations supérieures à 2pg/ml l'amphotéricine B complexée aussi bien aux lipoprotéines lourds, HDL qu'aux lipoprotéines légères, LDL montrent un effet toxique important équivalent à celui de l'amphotéricine B sous sa forme libre. (16 0/o seulement de K retenu.) 3 -En ce qui concerne l'effet de la densité cellulaire sur les phénomènes toxiques d'amphotéricine B, nos résultats montrent que la fuite du potassium intracellulaire des cellules de saccharomyces cerevisiae induite par l'amphotéricine B libre dépend non seulement de la concentration de l'antifongique, mais aussi de la densité cellulaire dans le milieu d'épreuve. Le contenu en potassium dans le milieu extérieur devient important lorsque la concentration de l'amphotéricine B et celle de la suspension cellulaire de saccharomyces cerevisiae augmente.4 - Par ailleurs, l'addition d'une source d'énergie tel que le glucose à lOmmol/l, ne modifie pas l'amplitude de cytotoxicité de l'amphotéricine B. Autrement dit, l'énergisation cellulaire ne semble pas protéger les cellules contre l'effet cytotoxique. Enfin, l'analyse détaillée des effets dose-réponse montrent qu'aux faibles concentrations d'amphotéricine B (inférieures à 2pglml), les lipoprotéines sériques montrent un effet protecteur relatif lorsqu'elles sont utilisées à des concentrations élevées (supérieures à 1OOJgIml de cholestérol total). Des concentrations supérieures ou égales à 2pg/ml sont nécessaires pour obtenir une activité inhibitrice pleine. Cet effet protecteur relatif suggère qu'un mécanisme d'internalisation des lipoprotéines sériques, notamment les lipoprotéines légères, LDL n'a pas lieu chez les levures de saccharomyces cerevisiae. Le seul mécanisme d'action, est le mécanisme classique, c'est-à-dire celui de l'interaction directe de l'amphotéricine B avec les constituants de la membrane plasmique en l'occurrence l'érgostérol. Cependant, la preuve expérimentale directe de l'absence des récepteurs aux LDL, chez les levures, nécessite une utilisation des lipoprotéines marquées sur leur partie apoprotéiques, et le suivi de leur devenir à l'intérieur de la cellule. Le prolongement naturel de notre travail est l'étude in vivo de l'effet des lipoprotéines sériques sur la toxicité de l'amphotéricine B. D'autre part, en faisant varier la composition des lipides aussi bien des cellules cibles que des lipoprotéines sériques on peut obtenir des informations complémentaires intéressantes sur les mécanismes de base des phénomènes de toxicité de l'amphotéricine B. Enfin ,une étude approfondie de l'effet de ces antifongiques sur les deux formes (libre et complexée aux lipoprotéines sériques sur le métabolisme cellulaire des cellules cibles permet de compléter l'étude de cet antifongique et de faire la part de ce qui revient aux effets purement membranaires et de ce qui revient aux effets sur le métabolisme cellulaire.