CONTRIBUTION A L’ETUDE DE LA DIFFUSION DES PROTEINES DANS LES GELS

Abstract

De nouveaux gels destinés à la séparation des protéines par électrophorèse ont été synthétisés à partir d'un mélange d'Acrylamide (AAm) et de Dextran à l'aide d'une polymérisation radicalaire en présence de l'agent réticulant N,N'-méthylène-bisacrylamide (Bis). La réaction a été initiée par le mélange d'ammonium persulfate (APS) et du N,N,N',N'-tétra-méthylène-diamine (TEMED). Les propriétés des gels synthétisés ont été étudiées par diverses techniques. La spectroscopie UV-Visible a permis de caractériser la variation de l'absorbance en fonction du temps et donc indirectement la cinétique de polymérisation. Cette cinétique a aussi été étudiée à travers le suivi de l'augmentation de la température de polymérisation en fonction du temps durant le processus/exothermique de la polymérisation. Une augmentation instantanée de la température â été observée à un moment donné décrivant le phénomène de type Trommsdorf attribué à la transition sol / gel. Le gonflement des gels synthétisés a également fait l'objet d'une étude dans l'eau dés-ionisée et dans la solution tampon. La cinétique de gonflement a été analysée dans les deux cas pour mettre en évidence l'effet de la pression osmotique due aux petits ions existant dans la solution tampon. L'application des gels synthétisés à la séparation de protéines connues jouant le rôle de marqueurs a été considérée en utilisant la technique de l'électrophorèse de type SDSPAGE. Les résultats de cette technique ont été interprétés à l'aide du tracé dit de Fergusson montrant le logarithme de la masse moléculaire des protéines en fonction du facteur de retardatibn Rf donné par le rapport de la distance de migration d'une fraction de protéines et la distance parcourue par l'éluant ou front de migration. La démarche adoptée dans celte thèse consistait à comparer les performances de gels synthétisés à base de PAAm / Dextran à celles du gel commercial Duracryl M de Genomics. Une étude détaillée a été effectuée mettant en relief les effets de la masse moléculaire et de la concentration de l'additif polysaccharide sur les différentes propriétés considérées et sur les performances de séparation de protéines standards par SDS PAGE.ABSTRACT Novel gels dedicated to the electrophoresis separation of proteins were synthesized from a mixture of acryl amide (AAm) and Dextran using a radical polymerization in the presence of the cross linker N,N-methylene-bis-acryl amide (Bis). The polymerization was initiated by the mixture of ammonium persulfate (APS) and N,N,N',N'-tetra methylene diamine (TEMED). The properties of the synthesized gels were studied by various techniques. UV-Vis spectroscopy was used to characterize the time dependence of absorbance during polymerization hence indirectly describing the kinetics. The same kinetics was also studied through the increase of temperature due to the heat produced by the exothermic polymerization process. A sudden rise of temperature was found at a certain time which was reminiscent of the Trommsdorf effect at the sol / gel transition. Swelling of the synthesized gels in de-ionized water and in the buffer solution was also characterized to identify the effects of the osmotic pressure due to small ions present in the buffer solution. Application of the synthesized gels to the separation of proteins was presented using the SDS-PAGE technique and standards dye proteins. The results were interpreted via Fergusson plots showing the logarithm of the proteins molar mass versus retardation factor Rf expressed as the ratio of the migration distance of a fraction of proteins and the distance covered by the eluant fluid. We systematically compared the results of the novel gels with those obtained from the commercial gel known as Duracryl™ from Genomics. A detailed study was performed to highlight the effects of the molar mass and concentration of the additive polysaccharide relative to different properties considered in this thesis and to the separation performances of standards proteins using SDS PAGE.