Domaine juxta-membranaire de la connexine43 : Détermination par RMN en solution de la structure et de l’interaction avec la tubuline et les microtubules

Abstract

microtubules Résumé Les connexines constituent une famille de protéines membranaires intégrales qui forment les jonctions communicantes. Ces protéines font partie d’une famille multigénique avec 21 isoformes chez l'homme. La Cx43 est le membre le plus abondant de cette famille et le plus étudié. Tout au long de son cycle de vie, la Cx43 est régulée à travers des modifications post-traductionnelles et/ou par des interactions protéine-protéine qui se produisent essentiellement au niveau de son domaine C-terminal (Cx43CT). Nous avons choisi d’étudier l’interaction de la tubuline et des microtubules avec un peptide (K26D) correspondant à la région juxta-membranaire (K234-D259) du domaine Cx43CT par RMN. Nos résultats ont démontré que la région juxta-membranaire de la Cx43 interagit directement et spécifiquement avec la tubuline et les microtubules et adopte lors de sa liaison à la tubuline une structure compacte hélicoïdale. En outre, nos travaux ont montré que cette interaction implique au moins deux groupes de résidus 239RV240 et 247YHAT250 du Cx43CT qui se trouvent à proximité immédiate de ces partenaires. Le résidu Y247, situé au sein d’un site de phosphorylation par la protéine kinase v-Src est impliqué dans l’interaction de la région juxta-membranaire de la Cx43 avec la tubuline et les microtubules. Pour cela, nous avons tenté d’étudier l’influence de la phosphorylation du résidu Y247 sur cette liaison. Nos résultats ont montré que cette interaction est négativement régulée par cette phosphorylation. Enfin, pour progresser dans la compréhension de la compétition entre la protéine Smad2 et la Cx43 pour leur liaison au système tubuline/microtubules. Nous avons étudié la compétition entre le peptide K26D et un autre peptide issu du domaine MH2 de la protéine Smad2 pour leur liaison à la tubuline. Nous avons démontré que la région M416-T434 du domaine MH2 incluse dans le peptide issu de la protéine Smad2 participe à sa liaison à la tubuline. Cependant, nous n’avons pas mis en évidence de compétition entre les peptides issus de Cx43 et de Smad2 pour leur interaction avec la tubuline. L’ensemble des résultats sont discutés en fonction de l’état de l’art et de la littérature. Abstract The connexins constitute a family of integral membrane proteins that form gap junctions. In humans, the connexins belong to a multigene family of 21 isoforms. Cx43 is the most abundant and studied member of this family. During its life cycle, Cx43 is regulated by post-translational modifications and/or protein-protein interactions that occur primarily in its C-terminal domain (Cx43CT). We chose to study the interaction of tubulin and microtubules with a peptide (K26D) corresponding to the juxtamembrane region (K234-D259) of the Cx43CT domain by NMR spectroscopy. We demonstrated that the juxtamembrane region of Cx43 interacts directly and specifically with tubulin and microtubules and adopt upon binding to tubulin a compact helical structure. In addition, our results showed that this interaction involves at least two clusters of residues 239RV240 and 247YHAT250 of Cx43CT which are in close proximity of these partners during interaction. The Y247 residue, located within a phosphorylation site by the protein kinase v-Src is involved in the interaction of the juxtamembrane region of the Cx43 with tubulin and microtubules. For this reason, we tried to study the influence of phosphorylation of the Y247 residue on this binding. Our results have shown that this interaction is negatively regulated by this phosphorylation. Finally, in order to progress in the understanding of the competition between Smad2 protein and Cx43 for their binding to the tubulin/microtubules system, we probed the putative competition between the K26D peptide and another one from the MH2 domain of Smad2 protein for their binding to tubulin. We succeeded showing that the binding of the Smad2 peptide to tubulin involves the M416-T434 region of its MH2 domain. However, we did note evidence a competition between the peptides derived from Cx43 and Smad2. The results are discussed in regards to the state of the art and of the current literature.