Evaluation des effets métaboliques d’un gavage par les pesticides (Mancozèbe, Métribuzine) chez le rat Wistar

Abstract

Les pesticides posent un véritable problème de santé publique, à la fois pour les utilisateurs, mais aussi pour la population générale. Il est maintenant établi que les populations fortement exposées aient un risque accru de développer des déficits immunitaires. Par ailleurs, peu d’études établissent le lien entre l’exposition aux pesticides et l’immunotoxicité. L’évaluation des effets toxiques de pesticides est complexe car de nombreux paramètres sont à considérer. Les atteintes chroniques dans lesquels les pesticides sont suspectés, ont été dénoncées par de nombreux scientifiques. Cependant, les études de risques prévues pour tester les pesticides sont insuffisantes pour objectiver leurs dangers potentiels, pour développer des politiques de protection de ces dangers. Ma thèse entre dans le contexte de l’analyse du risque constitué par les pesticides nécessitant de prendre en compte la vulnérabilité du développement précoce et les implications à long terme d’une programmation altérée sur le système immunitaire, le désordre métaboliques et le déséquilibre du statut rédox. Pour réaliser ce travail nous avons utilisé comme modèle expérimental in vitro, les lymphocytes humains et les splénocytes de rats considérée comme étant le modèle le plus connu et classiquement utilisé pour déterminer l’immunotoxicité de nouveaux produits chimiques, médicaments et xénobiotiques. Le premier résultat significatif de notre travail est que le Mancozèbe et la Métribuzine présentent un effet immunomodulateur important sur les deux sous-types de lymphocytes Th1 et Th2. Cette immunomodulation est similaire aussi bien chez les lymphocytes humains que chez les splénocytes de rats, avec une sensibilité plus importante observée avec les splénocytes. Le Mancozèbe entraine une chute de la prolifération lymphocytaire d’une manière dose-dépendante. Cependant, la Métribuzine est à la fois immunostimulatrice et immunosupréssive sur la prolifération lymphocytaire. Notre étude a prouvé que le même pesticide peut exercer les deux effets (stimulation et suppression) dépendant de la dose testée. Une réponse immunitaire de type Th1 est donc dominante, reflétant probablement l'effet inflammatoire du Mancozèbe, contrairement à la Métribuzine qui présente une dominance du profil Th1 sur les lymphocytes humains et les splénocytes de rat qui sont uniquement exposés à une forte concentration de la Métribuzine. Dans le même sens, les résultats de notre travail montrent l’existence d’un stress oxydant intracellulaire qui se manifeste par une augmentation des taux en hydroperoxydes et en protéines carbonylées, et une chute significative des teneurs en glutathion réduit (GSH) dans les lymphocytes et les splénocytes exposés au Mancozèbe. Ce fongicide entraine des variations dose-dépendantes sur le statut rédox des lymphocytes. CONCLUSION Par ailleurs, une augmentation significative des activités des enzymes antioxydantes est entrainée par ce pesticide. Le Mancozèbe induit une augmentation de l’activité de la catalase aux concentrations de 5 à 100 μM et une augmentation de l’activité de la superoxyde dismutase (SOD) à 100 μM. La Métribuzine provoque un stress oxydant intracellulaire seulement aux concentrations dépassants les 25 μM. L’augmentation des activités enzymatiques peut être en relation avec la présence du stress oxydatif intracellulaire, notamment à des concentrations fortes. Cependant, l’augmentation de l’activité des enzymes antioxydantes (CAT et SOD) peut présenter une réponse adaptative au stress oxydatif entrainé par les pesticides. Le statut oxydant/antioxydant des lymphocytes et des splénocytes présente une sensibilité équitable en présence des deux pesticides étudiés. Nos résultats obtenus montrent que, le Mancozèbe et la Métribuzine aux concentrations de 50 à 100 μM entrainent une augmentation significative des fréquences des micronoyaux, marqueurs des dommages cytogénétiques, au niveau des lymphocytes humains et des splénocytes de rats. Le second apport de nos travaux réside dans la démonstration des effets délétères d’une exposition chronique pendant deux mois aux deux pesticides, Mancozèbe et Métribuzine, chez des rats blancs de souche Wistar mâles et femelles, à des concentrations faibles. La plupart des études ultérieures utilisent des doses relativement fortes et les effets à faibles doses sont moins bien décrits. Les premiers résultats significatifs de notre étude in vivo montrent que les deux pesticides testés induisent une chute de poids corporel des rats consécutive à une perte d’appétit et une réduction d’apport énergétique quotidien. La réduction de la consommation alimentaire et de l’apport énergétique est de plus en plus importante lorsque la dose testée augmente et ceci concerne surtout le Mancozèbe. La chute du poids est associée à une diminution du tissu adipeux, une fonte musculaire, à une hyperglycémie, une hypercholestérolémie et une hypertriglycéridémie. Ces altérations sont associées à une élévation des taux sériques de créatinine et d’urée reflétant chez les rats mâles et femelles une toxicité dose-dépendante de la fonction rénale. De plus, ces perturbations biochimiques induites par les pesticides concernent l’augmentation dose-dépendante des teneurs en cholestérol et en triglycérides dans les fractions lipoprotéiques. Il faut aussi noter que les deux pesticides entrainent une augmentation des teneurs en lipides et protéines hépatiques, une réduction des lipides et protéines musculaires et une diminution des lipides du tissu adipeux, très accentuées avec les doses élevées. Ces anomalies correspondent à l’état catabolique induit par les pesticides. Concernant l’intestin, aucune variation du poids et des teneurs en lipides totaux et protéines n’est observée, ceci suggère que les deux pesticides n’influencent pas le métabolisme intestinal. CONCLUSION Une modification du statut oxydant / antioxydant est notée chez ces rats qui montrent une augmentation des teneurs plasmatiques et tissulaires en malondialdéhyde (MDA), diènes conjugués (DIC), protéines carbonylées (PCAR) et des marqueurs de l’oxydation des lipoprotéines en faveur d’un stress oxydatif évident. Les teneurs sériques en vitamine C et l’activité de la catalase sont réduites au niveau plasmatique, hépatique, musculaire et adipocytaire. Les teneurs en glutathion réduit (GSH) sont significativement réduites au niveau sanguin chez les rats traités par les deux types de pesticides. Il apparait que les teneurs en GSH au niveau du muscle, tissu adipeux et intestin sont maintenues normales alors que celles en GSH au niveau du foie sont réduites lors de l’exposition aux pesticides. Le foie est un organe très impliqué dans les réactions de détoxification de l’organisme et ceci peut expliquer la déplétion de ce tissu en GSH (considéré comme un antioxydant puissant) en présence d’un stress oxydatif. Il est possible que les pesticides agissent comme des générateurs de radicaux libres altérant les systèmes de défense des différents organes. La démonstration d’un lien de causalité entre l’exposition aux pesticides et la présence d’un impact sur la santé chez l’homme pourrait être apportée par des études comparatives entre des populations ayant une alimentation conventionnelle et biologique. En réalité, de telles études sont très difficiles à réaliser d’une façon rigoureuse et contrôlée ; elles nécessiteront un suivi assez prolongé (pendant plusieurs décennies ou générations) et l’implication d’un grand nombre de personnes ayant des régimes alimentaires identiques mais comportant une alimentation biologique ou des aliments conventionnels. Au cours de ces trois années de thèse, nous avons pu associer des approches expérimentales in vitro et in vivo afin d’aborder la problématique des effets de faibles doses de pesticides. Nous avons montré que ces pesticides à des faibles doses sont capables d’exercer des effets in vitro et in vivo. Cependant, les résultats de ces études ne peuvent être généralisés ni à l’homme, ni à l’ensemble des molécules (pesticides et autres contaminants) présents dans l’environnement. D’autres études seront donc nécessaires pour confirmer les hypothèses soulevées au cours de nos travaux. Perspectives Une des principales limites de nos études est l’état plutôt descriptif des résultats, lié pour beaucoup, au temps qui nous était impartis, 3 années, pour mettre en place, au laboratoire, la démarche conceptuelle ainsi que les approches techniques pour la développer. Nous avons encore besoin de temps pour explorer différentes pistes de recherche qui nous permettront de mieux évaluer et expliquer les phénomènes observés pendant ces 3 années. Les perspectives de ces travaux sont donc nombreuses et concernent les points suivants : -Le mécanisme d’action de la toxicité cellulaire in vitro : Bien que les méthodes utilisées in vitro aient permis l’observation d’un effet dû à l’exposition aux pesticides, elles ne renseignent pas de façon rigoureuse sur le mécanisme d’action de ces substances CONCLUSION ni sur la nature de ces effets c'est-à-dire par exemple les cibles affectées (ADN, protéines ou voies de signalisation, …), ni sur la gravité des effets (réversibilité, adaptabilité cellulaire). Ainsi, il serait nécessaire d’aborder d’autres approches afin de mieux comprendre l’effet des pesticides testés et d’essayer aussi d’établir des marqueurs d’effets dans notre modèle. Il serait également intéressant de tester des pesticides sur des lignées possédant des capacités métaboliques différentes et faire la relation métabolisme/effets. -Le mécanisme d’action de l’effet des pesticides in vivo : Il serait intéressant de prolonger la durée d’exposition des animaux afin de savoir si les perturbations fonctionnelles et moléculaires observées pourraient aboutir à l’apparition des pathologies. En parallèle, des études plus approfondies (étude de génotoxicité, comme par exemple l’utilisation d’un test de « comet » pour la recherche d’un dommage à l’ADN, ou des études de biologie moléculaire) permettront de savoir si une atteinte de l’ADN serait déclenchée de façon directe (formation d’adduits ou de cassures simples ou doubles brins) ou indirecte (dérégulation de facteurs de transcription via les voies de signalisation affectées) suite à l’exposition aux pesticides, et de conclure ainsi sur la possibilité d’un lien direct avec le développement de pathologies comme le cancer.